Методи отримання генетично-модифікованих рослин

автор: Чекалин Н.М., доктор биологических наук, Тищенко В.Н., доктор сельскохозяйственных наук, Баташова М.Е.

источник: Селекция и генетика отдельных культур // Н.М. Чекалин, В.Н. Тищенко, М.Е. Баташова

Біотехнологія продовжує повсюдно інтенсивно розвиватися. У 2007 р. у світі трансгенними культурами було засіяно біля 110 млн гектарів більш чим у 20 країнах ( у т.ч. і у європейських). До 2015 р. цей показник, як думають, досягне 200 млн гектарів, що складає біля 14% усіх оброблюваних на землі площ. У 2007 р. у світі зареєстровано і допущено до промислового виробництва 168 сортів та гібридів генетично модифікованих рослин 20 провідних сіьськьгосподарських культур, куди війшли соя, кукурудза, ріпак, цукровий буряк, пшениця, ячмінь, соняшник та ін. З часу піонерських робіт у галузі генної інженерії рослин перелік завдань, які вирішують дослідники, значно розширився. Якщо перші дослідження були зосереджені, насамперед, на трансформації рослин за ознаками, що можуть мати певне значення для сільського господарства (стійкість до вірусів, певних гербіцидів та шкідників), то зараз спектр питань у цьому напрямку значно більший (табл. 1) Можна згадати про генно-інженерні рослини, що мають стійкість до посухи та інших абіотичних стресів; відстрочений час дозрівання плодів та модифікований час цвітіння; рослини зі зміненим жирно-кислотним складом та зі зміненим метаболізмом, що дозволяє синтезувати нові сполуки в рослині; рослини зі збалансованим складом окремих компонентів; рослини, здатні очищати довкілля від органічних та неорганічних поллютантів; рослини, здатні синтезувати різноманітні фармпрепарати. Передумовою розвитку генної інженерії рослин стали процеси, що відбуваються в природі без участі людини. Природним чином трансформація рослин здійснюється за допомогою ґрунтових бактерій Agrobactеrium tumefaciens. При пошкодженні рослини в ній починає синтезуватись специфічна речовина. У відповідь на цей хімічний сигнал A. tumefaciens приєднується до мембрани рослинної клітини, після чого відбувається перенос частини Т-ДНК бактеріальної плазміди (Ті-плазміди) в ядро рослинної клітини. Т-ДНК вміщує гени, що кодують ферменти синтезу фітогормонів, які викликають збільшення розмірів рослинних клітин та їх проліферацію. Крім того, рослинні клітини починають синтезувати опін, що кодується Т-ДНК, який може використовувати тільки A. tumefaciens. Таким чином, у процесі еволюції сформувався механізм перетворення рослинної клітини на "фабрику" з виробництва речовини — джерела вуглецю та нітрогену (опіну) виключно для потреб A. tumefaciens. Щоб використати природну здібність A. tumefaciens потрапляти в рослинні клітини для доставки в них клонованих генів, були створені модифіковані Ті-плазміди. З Т-ДНК видаляли гени фітогормонів та гени метаболізму опіну та вбудовували таку змінену Т-ДНК у плазміду. Вбудований в Т-ДНК ген-мішень попадає разом із нею в ядро рослинної клітини-реципієнта. У випадку бінарної системи човниковий вектор із клонованим у Т-ДНК геном вводять у штам Agrobacterium tumefaciens, що несе модифіковану плазміду з геном, необхідним для переносу Т-ДНК, у клітину рослини (vir-генами). Крім того, розроблена також коінтегративна система, яка дозволяє введення човникового вектора в A. tumefaciens, де він рекомбінує з неонкогенною Ті-плазмідою, що несе vir-гени, з утворенням плазміди, в якій є і функціонуючі vir-гени, і Т-ДНК з клонованим геном. Ділянки Т-ДНК A. tumefaciеns використовували для введення генів у різні рослини. На жаль, ця система може бути застосована не для всіх видів рослин. Ефективними методами доставки ДНК у різні рослинні клітини є також бомбардування мікрочастинками (біолістика), метод мікроін’єкцій ДНК, соматична гібридизація та деякі інші, більш сучасні методи. Для забезпечення експресії чужорідних генів і введення в рослинні клітини використовують різні промотори. Розроблені також методи вбудовування чужорідних геній безпосередньо в хлоропластну та мітохондріальну ДНК так, що кодований білок синтезується прямо в цих органелах. Системи трансформації повинні відповідати таким вимогам: забезпечувати стабільну інтеграцію чужорідної ДНК у геном господаря без структурних ушкоджень принесеної ДНК; інтегрувати якомога більше число копій ДНК; забезпечити стабільність нового генотипу впродовж багатьох генерацій; в ідеалі, забезпечити тканино-специфічну регуляцію та онтогенез-специфічну регуляцію принесеного гена. Системи переносу генів за допомогою A. tumefaciens ефективно працюють тільки у випадку деяких видів рослин. Зокрема, однодольні рослини, включаючи головні зернові культури (рис, пшеницю, кукурудзу), практично не трансформуються A. tumefaciens. Однак, дещо модифікувавши методику і контролюючи умови, вдалося трансформувати кукурудзу та рис агробактеріями, які несуть вектори-похідні Ті-плазмід. Для цього, наприклад, незрілі зародки кукурудзи поміщали на кілька хвилин у суспензію клітин A. tumefaciens, а потім інкубували кілька днів у відсутності селективного тиску, після чого зародки переносили в середовище з антибіотиками, в якому могли рости тільки трансформовані рослинні клітини. Клітини витримували в темноті протягом кількох тижнів, потім переносили на інше поживне середовище та інкубували на світлі з метою регенерації цілої трансформованої рослини. Деякі з методів трансформації вимагають руйнування клітинної стінки з утворенням протопластів. Останні підтримують в культурі як клітини, що ростуть незалежно або у відповідному поживному середовищі, де клітини утворюють клітинні стінки. З таких клітин можливо регенерувати цілу рослину. Крім того, розроблені методи трансформації, що дозволяють вводити клонований ген у невелику кількість клітин рослинної тканини, з якої можливо регенерувати цілу клітину, обходячись без регенерації з протопластів. На сьогоднішній день для доставки ДНК у клітини рослин надають перевагу або векторам на основі Ті-плазмід, або бомбардуванню мікрочастинками. Таким чином було генетично трансформовано близько 100 різних видів рослин. Трансформація рослин Ті-плазмідою із Agrobacterium tumefaciens Грам-негативна ґрунтова бактерія Agrobacterium tumefaciens — фітопатоген, який у процесі свого життєвого циклу трансформує клітини рослин. Ця трансформація призводить до утворення корончатого гала — пухлини, яка шкодить росту рослини. Це захворювання властиве тільки для дводольних рослин. Утворення корончатого гала починається з інтеграції в геном рослинної клітини специфічного сегмента бактеріальної плазмідної ДНК, так званої Т-ДНК (від англ. Transferred DNA), та її експресії. Т-ДНК — це частина плазміди, що індукує розвиток пухлини, довжина Т-ДНК варіює від 12 до 24 т.п.н. (тис. пар нуклеотидів) залежно від штаму. Інфекційний процес починається з прикріплення A. tumefaciens до клітин рослин у місці пошкодження. Рослини в пошкоджених місцях виділяють специфічні фенольні сполуки — ацетосирінгтон та гідроксиацетосирінгтон. Саме ці сполуки активують гени вірулентності (vir), які локалізовані в ділянці Ті-плазміди довжиною 35 т.п.н. та знаходяться за Т-ДНК. Продукти vir-генів необхідні для транспорту та інтеграції Т-ДНК у геном рослинної клітини; існує приблизно 7 різних vir-генів. Т-ДНК транспортується в клітину після приєднання A. tumefaciens до рослинної клітини та активації vir-генів. При цьому Т-ДНК знаходиться в одноланцюговій формі, і саме в цій формі вона вбудовується в хромосомну ДНК рослин. Більшість генів Т-ДНК активуються тільки після її вбудовування в геном рослин, їх продукти і викликають утворення корончатого гала. Найпростіше використання природної здатності Ті-плазмід у генетичній трансформації рослин полягає в можливості вбудовування певного гена, що викликає зацікавленість ("ген інтересу") в Т-ДНК, а потім використання Ті-плазмід та А. tumefaciens для доставки та вбудовування клонованого гена компетентній рослинній клітині. Не зважаючи на те, що Ті-плазміди є ефективними природними векторами, є ряд обмежень на їх використання як вектора для клонування: Фітогормони, що синтезуються трансформованими клітинами в культурі, подавляють регенерацію зрілої рослини з цих клітин, тому при конструюванні векторів на основі Ті-плазмід гени ауксинів та цитокінінів повинні бути вилучені. Ген опіну несуттєвий для трансгенних рослин, але при його наявності може знижуватись кінцевий вихід біомаси, оскільки частина ресурсів іде на синтез опіну. Відповідно, при створенні векторів ген опіну треба вилучити. Ті-плазміди мають досить великі розміри (від 200 до 800 т.п.н.), а для експериментів з рекомбінантними ДНК ефективніші вектори меншого розміру, тому ділянки ДНК, що не мають значення для клонуючого вектора, повинні бути вилучені. Ті-плазміди не реплікуються в Е. coli, що виключає роботу з рекомбінантними Ті-плазмідами в цих бактеріях. Таким чином, при конструюванні векторів на основі Ті-плазмід необхідно ввести в них сайт ініціації реплікації, який забезпечував би їх підтримку в Е. coli. Не зважаючи на всі ці труднощі, сконструйовано кілька векторів для рослинних клітин. Всі вектори на основі Ті-плазмід організовані подібним чином та мають наступні елементи: Селективний маркерний ген. Прикладом такого гена, досить часто вживаного раніше, може бути ген неоміцинфосфаттрансферази, який забезпечує стійкість трансформованих рослинних клітин до канаміцину. Оскільки цей ген (як і багато інших маркерних генів, що використовують при трансформації рослин) за своєю природою прокаріотичний, необхідно поставити його під контроль рослинних (еукаріотичних) сигналів регуляції транскрипції, в тому числі промотори і сигналу термінації-поліаденілювання з метою ефективної експресії гена в трансформованих рослинних клітинах. Сайт ініціації реплікації, який дозволяє плазміді реплікуватись в Е. coli. Права фланкуюча послідовність Т-ДНК. Цей елемент необхідний для інтеграції Т-ДНК у клітинну ДНК рослин. Більшість векторів мають як праву, так і ліву фланкуючі послідовності. Полілінкeр (численний сайт клонування) для включення гена в ділянку між кордонами Т-ДНК. Оскільки клонуючі вектори не мають генів vir, вони самі не здатні забезпечити транспорт та інтеграцію Т-ДНК у клітини рослин. Із метою вирішення цього питання розроблено два підходи. У першому випадку використовують бінарну векторну систему. Бінарний клонуючий вектор має сайти ініціації реплікації як для A. tumefaciens, так і для Е. colі, але не несе генів vir. Тобто це практично човниковий вектор A. tumefaciens — E. coli. Всі стадії клонування проводять в Е. сolі, а потім вектор вводять в А. tumefaciens. Штам-реципієнт A. tumefaciens несе модифіковану неонкогенну Ті-плазміду, яка вміщує повний набір vir-генів, але з неї видалено частину Т-ДНК. У цій системі на неонкогенній Ті-плазміді синтезуються продукти vir-генів, які мобілізують ділянку Т-ДНК бінарного клонуючого вектора. Продукуючи білки, що кодують vir-гени, неонкогенна Ті-плазміда виступає в ролі помічника, сприяє вбудовуванню Т-ДНК з бінарного клонуючого вектора в хромосомну ДНК рослин. В іншому випадку використовують коінтегративну векторну систему. Векторна ДНК рекомбінує в A. tumefaciens із "роззброєною" Ті-плазмідою, Т-ДНК якої не несе пухлинних генів. Таким чином, весь клонуючий вектор вбудовується в неонкогенну Ті-плазміду. Коінтегративний вектор та не онкогенна Ті-плазміда-помічник вміщують гомологічні послідовності, які утворюють сайт для гомологічної рекомбінації in vivo. Ці послідовності розміщуються в Т-ДНК, після рекомбінації клонуючий вектор стає частиною неонкогенної Ті-плазміди, яка вміщує vir-гени, необхідні для переносу Т-ДНК у рослинну клітину. Єдиний спосіб підтримки клонуючого вектора в A.t. — це використання такої коінтегративної структури, в конфігурації якої генетично сконструйована ділянка Т-ДНК може бути перенесена в рослинні клітини. Фізичні методи переносу генів у рослинні клітини Бомбардування мікрочастинками або біолістика — це найбільш багатообіцяючий метод введення ДНК у рослинні клітини. Золоті або вольфрамові сферичні частинки діаметром 0.4—1.2 мкм покривають ДНК, яка осаджена СаСl2, спермідином або поліетиленгліколем, та "вистрілюють" ними в клітини зі спеціальної "рушниці", яку приводять у дію газами, що утворюються при згоранні пороху, стисненим повітрям або гелієм. Частинки розганяються до швидкості 300—600 м/с і пробивають клітинну стінку та мембрани рослинної клітини. При цьому їх густина така, що клітини практично не пошкоджуються. Попадаючи в клітину, ДНК, що покриває частинки, якимось невідомим чином інтегрується в рослинну ДНК. Метод бомбардування мікрочастинками дозволяє трансформувати рослини самих різних видів, у т.ч. однодольних та хвойних, в які не вдається ввести ДНК за допомогою агробактерії. Бомбардування мікрочастинками можливо використовувати також для введення чужорідної ДНК у суспензію рослинних клітин, культуру клітин, меристематичні клітини, незрілі зародки, колеоптилі та пилок широкого кола клітин. Крім того, за допомогою цього метода були транспортовані гени її в хлоропласті та мітохондрії. На поверхні мікрочастинок можливо осадити плазмідну ДНК, розчинену в буфері, що дозволяє підвищити частоту трансформації збільшенням кількості плазмідної ДНК, але треба мати на увазі, що занадто велика її кількість може бути летальною для клітини. У трансформованих таким чином клітинах, які ідентифікують по експресії маркерного гена, введена ДНК часто експресується тільки тимчасово. Поки чужорідна ДНК не вбудувалась у геном рослини, вона з великою вірогідністю втрачається під час ділення трансформованих клітин (табл. 2.) Застосування репортерних генів при трансформації клітин рослин Для ідентифікації трансформованих клітин необхідно вміти виявити чужорідну ДНК, що інтегрується в геномну ДНК рослин. Більше того, при дослідженні сигналів регуляції транскрипції та їх функцій в специфічнихрослинних клітинах (листках, коріннях та квітах) важливо оцінити рівень експресії гена, що кодує легко ідентифікований продукт. Все це вимагає використання репортерних генів, які дозволяють аби проводити відбір трансформованих клітин, або оцінити активність кодованого ними ферменту. Було протестовано кілька різних генів, які можливо використовувати як домінантні селективні маркери, і генів, продукт експресії яких можливо спостерігати за допомогою специфічних методів. Таблиця №1 Завдання, що вирішуються при створенні біотехнологічних рослин Завдання Нові ознаки та властивости 1. Якість продукції Метаболізм вуглеводів Колір Тривалість зберігання Метаболізм жирних кислот Стійкість Затримка дозрівання фруктів та овочів Зменшення вартості переробки 2. Стійкість до хвороб, шкідників Бактерій, грибів, комах, нематод, вирусів 3. Агрономічні показники Стійкість до посухи Резистентність до гербіцидів Зменшення потреби в азотному живленні Стійкість до засолення Стійкість до температурних факторів 4. Енвайронментальні біотехнології Деградація in situ органічних поллютантів Фіторемедіація важких металів 5.Синтез фармпрепаратів та інших сполук Синтез вакцин, гормонів, фармацевтичних білків та моноклональних антитіл Синтез мономерів біодеградуючого пластику Таблиця №2 Приклади трансгенних рослин, отриманих шляхом бомбарду-вання рослинних клітин мікрочастинками Рослина Джерело клітин Кукурудза Суспензія зародкових клітин, незрілих зиготичних зародків Рис Незрілі зиготичні зародки, зародковий калус Ячмінь Суспензія клітин, незрілі зиготичні зародки Пшениця Незрілі зиготичні зародки Дерноутворюючі злаки Зародковий калус Жито Меристема Сорго Незрілі зиготичні зародки Просо Незрілі зиготичні зародки Банан Суспензія зародкових клітин Тополя Калус Ялина європейська та канадська Соматичні зародки Горох Зиготичні зародки Огірок Зародковий калус Батат Калус Клюква Отримані in vitro частини пагона Піон Пилок Люцерна Зародковий калус Боби Зиготичні зародки Бавовна Зиготичні зародки Виноград Суспензія зародкових клітин Земляний горіх Зародковий калус Тютюн Пилок Оскільки багато з репортерних генів мають бактеріальне походження, вони були забезпечені регуляторними послідовностями з метою їх експресії в рослинних клітинах. Наприклад, у присутності канаміцина виживають лише клітини рослин, що синтезують активну неоміцинфосфаттрансферазу. Вибір того чи іншого репортерного гена визначається характером конкретного експерименту. Якщо експресія гена шкодить нормальному росту рослини, то його неможливо використовувати як репортерний. Крім того, присутність деяких генів та їх продуктів може призводити до забруднення комерційного продукту. У зв’язку з цим уникають вводити гени стійкості до антибіотиків у сільськогосподарські рослини. Деякі продукти репортерних генів (наприклад, b-D-глюкуронідаза, а також люцефераза, що синтезується бактеріями та світлячками) можливо спостерігати в інтактних рослинних клітинах. У системах трансформації головним чином використовували ген b-глюкуронідази E. coli (GUS-ген), який кодує стабільний фермент, відсутній в рослинах, та каталізує розщеплення b-глюкуронідів. Активність гена в трансформованих рослинних тканинах можливо виявити за наявністю синього забарвлення в результаті гідролізу нефарбованого субстрату, 5-бром-4-хлор-3-індоліл-b-D-глюкуронової кислоти. Альтернативний, більш чутливий метод кількісної оцінки активності GUS-генів у рослинних екстрактах, оснований на визначенні інтенсивності флуоресценції продукту гідролізу 4-метилумбел-ліферилу, b-D-глюкуроніду. Експресія чужинних генів у рослинах Після того, як методика трансформації рослин була повністю відпрацьована, дослідники спробували вводити різні рослинні і бактеріальні гени в клітини самих різних рослин. Трансформовані рослини перевіряли на здатність до синтезу чужорідних білків, проводили фізіологічні дослідження, щоб дослідити, як присутність цього білка позначається на всій рослині. У багатьох ранніх експериментах використовували промотори, які контролюють конститутивну експресію ряду рослинних клітин. Не так давно були виділені та охарактеризовані рослинні промотори, які контролюють експресію чужорідних білків у специфічних клітинах на певних стадіях росту та розвитку рослини. Наприклад, замість сильного конститутивного 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти, функціонуючого в усіх рослинних клітинах протягом усього життя рослини, можна використовувати промотор гена малої суб’одиниці фотосинтетичного ферменту рибулозобіфосфат-карбоксилази (РБФК, RUBISCO), який працює тільки у фотосинтезуючих тканинах, наприклад у листках. Аналогічно для контролю експресії деяких чужорідних генів використовують рослинні промотори, що функціонують тільки в специфічних тканинах та за сприятливих умов. Більшість генів рослин локалізована в ядерній ДНК, але хлоропласти та мітохондрії теж вміщують гени, які кодують ряд важливих та унікальних функцій. При цьому не всі білки, що знаходяться в цих органелах, закодовані в їх ДНК — деякі з них кодуються ядерною ДНК, синтезуються в цитоплазмі, а потім за допомогою специфічних механізмів імпортуються у відповідну органелу. Є два шляхи введення специфічного чужорідного білка в мітохондрії та хлоропласти. Один зі способів — це злиття генів, які кодують чужорідний білок, та послідовності сигнального пептиду, що направляє білки в органели. Така конструкція може бути вбудована в хромосомну ДНК, а рекомбінантний білок буде імпортуватись у відповідну органелу. Другий спосіб припускає вбудовування гена, що кодує чужорідний білок, безпосередньо в хлоропластну або мітохондріальну ДНК. Для виділення рослинних промоторів із деяких видів рослин використовують спеціалізовані (так звані "промотор-направлені") вектори і систему трансформації на основі Ті-плазмід Agrobacterium. Суть підходу наступна: репортерний ген без промотора вбудовують відразу за правою фланкуючою послідовністю вектора на основі Ті-плазміди, а після переносу Т-ДНК у хромосому рослин він опиняється в оточенні рослинної ДНК. Якщо Т-ДНК вбудовується в промоторну ділянку функціонального гена, то відбувається транскрипція репортерного гена. Для ідентифікації рослинних промоторів як репортерного гена можливо використання неоміцинфосфат-трансферази. При цьому експресію даного гена можливо проконтролювати підбором канаміцинстійких трансформантів. Щоб бути впевненим у відборі саме трансформованих клітин, у Т-ДНК відразу за репортерним геном без промотора вбудовують ген стійкості до гігроміцину, що знаходиться під контролем промотора. Спочатку відбирають гігроміцинстійкі клітини, а потім перевіряють ферментативну активність трансформантів в умовах, які забезпечують експресію репортерного гена. У результаті спостерігається, що від 5 до 30% трансформованих рослинних клітин несуть репортерний ген, який знаходиться під контролем активного промотора. 35S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти часто використовують у рослинних системах як сильний промотор, але рівень експресії гена, що контролює даний промотор, часто нижчий, ніж хотілося би. З метою вирішення цієї проблеми і пошуку найефективнішого промотора, необхідно тестувати в рослинах різні конструкції "промотор-ген". Крім промотора, експресію чужорідного гена можуть посилювати інші елементи, зокрема енхансерні послідовності, розташовані на відстані від одної до кількох сотень нуклеотидів від промотора, інтрони, що стабілізують мРНК, та сигнали термінації транскрипції. Були протестовані ДНК-конструкції, що вміщують всі або деякі з наступних елементів: 35S промотор; сигнал термінації транскрипції гена нопалінсинтетази; від одного до семи тандемних повторів енхансерних елементів; так звана W-послідовність, яка збільшує експресію гена на рівні трансляції. Найефективніша конструкція вміщувала сім енхансерних елементів, при цьому рівень експресії чужорідного гена в трансгенних рослинах тютюну та рису був набагато вищий, ніж у випадку одного 35S промотора. Протестовані промотори і конструкції контролювали експресію кола чужорідних генів у трансгенних рослинах. Таке різноманіття може пояснюватися тим, що Т-ДНК вбудовується в різні сайти в геномі рослин. Використовуючи цей підхід, можливо утворювати сильні тканиноспецифічні промотори, що регулюються в процесі розвитку. Введення чужинних генів у пластидну ДНК Пластиди — це клітинні органели, що мають власний геном та свою систему трансляції-транскрипції. Пластидний геном (або пластом, або ptDNK) — це високоплоїдна ДНК, що має розмір від 120 до 180 т.п.н. та кодує приблизно 120 генів. Пластиди — це загальна назва органел, до яких належать пропластиди (попередники пластид усіх типів), хлоропласти (зелені пластиди), хромопласти (жовті, або червоні у деяких фруктів та квітів) та різні типи білих пластид, таких як амілопласти (містять крохмаль) та елаоілопласти (містять жири). Функції пластид включають фотосинтез та синтез крохмалю, амінокислот, ліпідів та пігментів. Більшість із пластидних генів кодується 2100—3600 ядерними генами, продукти яких транслюються на цитоплазматичних рибосомах та трансформуються потім у пластиди. Рослини зі трансформованим пластидним геномом називають транспластомними. Вперше з трансформованими хлоропластами були отримані рослини тютюну в 1990 р. в лабораторії проф. Маліга, і найбільших успіхів сьогодні досягнуто саме при трансформації хлоропластів. У більшості вищих рослин у кожній клітині листка присутні приблизно 100 хлоропластів, і кожний хлоропласт вміщує приблизно 100 копій хлоропластної ДНК. Для стабільної генетичної трансформації хлоропластів із метою зміни їх функціональних характеристик необхідно вводити чужорідні гени в хлоропластну, а не в хромосомну ДНК, довжина якої в 104—105 разів більша. Крім того, необхідно, щоб чужорідні гени були присутні в усіх із приблизно 10 молекул хлоропластної ДНК, яка вміщується в одній клітині. Спочатку чужорідні гени вводили в ДНК хлоропластів у складі плазмідного вектора, який несе селективні чужорідну ДНК та маркер, наприклад ген стійкості до антибіотиків, фланкований специфічними послідовностями хлоропластної ДНК. Така стратегія була дуже ефективною, але нерідко селективний маркер заважав експресії фланкуючих хлоропластних генів. Щоб вирішити цю проблему, розробили стратегію, в якій селективний маркер та чужорідний ген не були фізично пов’язані один з одним. Для цього рослини тютюну трансформували сумішшю однакової кількості двох різних плазмід: одна вміщувала селективний маркер (ген стійкості до спектиноміцину), фланкований ДНК з одної ділянки хлоропластної ДНК, а інша — чужорідний ген (ген стійкості до канаміцину), фланкований послідовностями з другої ділянки хлоропластної ДНК. Обидва гени мали прокаріотичні сигнали транскрипції, що забезпечувало їх транскрипцію в хлоропластах, але не в ядрі. Послідовності хлоропластної ДНК у плазміді організовані таким чином, що рекомбінація або вбудовування в геном хлоропластів не призводило до порушення роботи будь-якого хлоропластного гена. Плазміди вводили методом бомбардування мікрочастинками, а потім відбирали трансформовані рослини тютюну на середовищі зі спектиноміцином. Хлоропласти з відібраних трансформантів перевіряли на наявність продукту, детермінованого геном стійкості до канаміцину (неселективним чужорідним геном). Приблизно 30% трансформантів експресували ген стійкості до канаміцину, що вказує на використання котрансформації для введення чужорідних генів у хлоропласту ДНК. З часу цих піонерських робіт вирішено багато методичних питань, що дозволило отримати значну кількість транспластомних рослин, які мають корисні біотехнологічні ознаки (табл. 3). Таблиця №3 Пластидні трансгени та їх властивості Ген Продукт bar Стійкість до гербіциду РРТ СР4 Стійкість до гербіциду гліфосат Ic-EPSPSc Стійкість до гербіциду гліфосат cry 1 Ac Bt-захист від комах cry2Aa2 Bt-захист від комах cry 11а5 Bt-захист від комах Соматотропін Гормон росту людини СТВ Суб’одиниця В холерного токсину TetC Вакцина від сказу HSA Сиворотковий альбумін людини РВР Білковий полімер ASA2 Біосинтез триптофану MS 1-99 Антимікробний пептид phb оперон Полігідроксибутират TPSl Трихалозофосфатсинтетаза merA Ртутьредуктаза merB Органортутьліаза Питанню отримання транспластомних рослин останнім часом приділяється досить уваги через те, що вважається, що для таких рослин практично не може відбуватися перенесення генів між трансгенами і їх дикими родичами і, відповідно, такі рослини не наносять шкоди довкіллю. Оскільки пластидний геном є високоплоїдним, трансформація хлоропластів дозволяє інтродукувати тисячі копій чужорідного гена в рослинну клітину і, тим самим, забезпечити високий рівень синтезу чужорідного білка в клітині. Нарешті, трансформацію протопластів можна зробити більш цілеспрямованою, з огляду на позиціонування принесеного гена, порівняно з ядерним геномом. Отримання трансгенних рослин без маркерних генів При введенні чужорідного гена в рослини вводять і селективний маркерний ген. Хоч до цього часу не було ніяких відомостей про те, що будь-який з цих генів може шкідливо впливати на людину, тварин і навколишне середовище, наслідки, до яких у принципі можуть призвести включення в рослини селективних маркерних генів, викликають занепокоєння суспільства. Наприклад, продукти деяких селективних маркерних генів можуть бути алергенними або токсичними речовинами, а гени стійкості до антибіотиків можуть потрапити в патогенні грунтові мікроорганізми. Крім того, присутність селективних маркерів технічно ускладнює трансформацію трансгенннх рослин додатковими генами, оскільки один селективний маркер не може використовуватись двічі. Щоб заспокоїти громадськість, були розроблені методи отримання трансгенних рослин без будь-яких маркерних генів. Один з експериментальних підходів до отримання безмаркерних трансгенних рослин включає котрансформацію рослин двома різними ДНК, одна з яких несе маркерний ген, а інша — послідовність, цікаву для дослідника. У цьому випадку від 30 до 80% рослин вміщують обидва гени, які, однак, інтегровані в різні сайти хромосомної ДНК. Після відбору трансформантів маркерний ген можна видалити з трансгенної рослини за допомогою простого схрещування. У рамках другого підходу селективний маркерний ген вбудовують між рослинними мобільними елементами (Ds-елементами) і таку конструкцію вводять в Т-ДНК разом із геном транспозона, яка вирізає ділянку ДНК між Ds-елементами і переміщує його в другий хромосомний сайт. У процесі вбудовування Т-ДНК у ДНК рослини-господаря в 90% випадків селективний маркер, який знаходиться між двома Ds-елементами, опиняється в другому сайті хромосомної ДНК, при цьому з вірогідністю 50% цей сайт знаходиться далеко від початкового. Таким чином, селективний маркерний ген можна використовувати для ідентифікації трансформованих рослин, а потім виділяти при схрещуванні. Джерело